Mokslininkų komandai iš VU Biotechnologijos instituto Baltymų-nukleorūgščių sąveikos tyrimo skyriaus – dr. Giedriui Sasnauskui, dr. Gintautui Tamulaičiui ir dr. Mindaugui Zarembai – 2014 m. Lietuvos mokslo premija biomedicinos ir žemės ūkio mokslų srityje skirta už darbų ciklą „Nauji taikiniui specifinių endonukleazių sąveikos su DNR reguliacijos ir katalizės mechanizmai (2002–2013)“. Mokslininkų atlikti tyrimai parodė, kokie įvairūs yra DNR taikinių atpažinimo mechanizmai, katalizuojamos reakcijos ir aktyvumą valdantys „užraktai“, DNR karpančių fermentų sandara.

Tiria „molekulines žirkles“

Dr. G. Sasnausko, dr. G. Tamulaičio ir dr. M. Zarembos tyrimo objektas yra restrikcijos endonukleazės. Tai fermentai, kurie geba atpažinti tam tikras DNR molekulės sekas – „taikinius“ ir ties jomis DNR perkirpti. Dėl to šie baltymai dažnai vadinami „molekulinėmis žirklėmis“, karpančiomis gyvųjų organizmų genetinės medžiagos DNR „siūlus“.

„Didžioji mūsų darbo dalis buvo skirta fundamentiniams restrikcijos fermentų struktūros, DNR taikinio atpažinimo, katalizuojamų reakcijų ir aktyvumo reguliacijos tyrimams. Mūsų darbas leido geriau suprasti, kaip šios „molekulinės žirklės“ sukonstruotos, kaip atpažįsta skirtingus DNR taikinius, kaip perkerpa DNR ir kaip „įjungiamas“ ar „išjungiamas“ jų aktyvumas“, – paaiškina dr. G. Sasnauskas. Jam su kolegomis pavyko parodyti, kad restrikcijos fermentai, nepaisant panašaus jų gamtinio vaidmens, gali smarkiai skirtis savo sandara, DNR atpažinimo būdu ir katalizuojamomis reakcijomis.

Mokslininkų komandai pavyko atrasti naują taikiniui specifinių endonukleazių DNR taikinio atpažinimo būdą, naują endonukleazių katalizuojamų reakcijų tipą, atskleisti, kokiais būdais vieną katalizės centrą turintis baltymas geba perkirpti abi DNR grandines ir kaip reguliuojamas kai kurių restrikcijos fermentų aktyvumas. Tai leido konstruoti naujus DNR karpymo įrankius ar pasiūlyti naujų restrikcijos endonukleazių panaudojimo būdų.

Tarp VU Biotechnologijos instituto mokslininkų sukurtų naujų DNR karpymo įrankių yra fermentų, kerpančių ne abi, o tik vieną iš dviejų DNR grandinių, taip pat fermentai, atpažįstantys pailgintus DNR taikinius. „Mūsų sukonstruotos ilgus DNR taikinius atpažįstančios nukleazės ypatingos tuo, kad jos kerpa DNR tik ties tam tikru ilgu DNR taikiniu, neliesdamos įprastiniam fermentui būdingų ir daug dažniau pasitaikančių trumpų DNR taikinių. Be to, pademonstravome galimybę tokių fermentų aktyvumą „įjungti“ padedant šviesai“, – DNR taikinius atpažįstančių nukleazių ypatumus vardija dr. G. Sasnauskas. Šiuo atveju prie nukleazės prijungiama šviesai jautri cheminė grupė, neleidžianti susidaryti aktyviai fermento formai. Baltymą paveikus šviesa, ši grupė nuo baltymo atskyla ir susidaro aktyvi endonukleazė.

Lietuvoje atrasta nemažai restrikcijos fermentų

Restrikcijos fermentai atrasti daugiau nei prieš 40 metų įvairiose bakterijose. Natūralus šių fermentų vaidmuo – saugoti bakterijas šeimininkes nuo jas puolančių virusų, vadinamų bakteriofagais. Dr. G. Sasnausko teigimu, restrikcijos fermentai sukarpo į ląstelės vidų patekusią virusinę DNR, taip sustabdydami viruso dauginimąsi. Mokslininkas išskiria svarbų šių fermentų „nuopelną“, dėl kurio maždaug prieš 40 metų įvyko tikra revoliucija molekulinės biologijos tyrimuose, biotechnologijoje ir medicinoje: „Restrikcijos endonukleazių gebėjimas tiksliai karpyti DNR leido atsirasti genų inžinerijai, kurios esmė – pagal žmogaus poreikius pertvarkyti genetinę informaciją: karpyti, jungti įvairius baltymus koduojančius genus, juos perkelti iš vieno organizmo į kitą. Pavyzdžiui, tai leido priversti bakterijas sintetinti žmogaus insuliną ar kitus vaistų gamybai naudojamus baltymus.“ Taigi restrikcijos endonukleazes galima vadinti vienu svarbiausių veiksnių, lėmusių žmonijos pažangą praėjusio amžiaus antroje pusėje.

Šiuo metu aprašyta apie 4000 restrikcijos fermentų, atpažįstančių apie 300 skirtingų DNR taikinių. Pasak VU biotechnologų, nemažai šių fermentų atrasta Lietuvoje, dabartinio VU Biotechnologijos instituto pirmtake – Taikomosios enzimologijos institute ir jo pumpurinėje bendrovėje „Fermentas“ (dabar „Thermo Fisher Scientific“ Vilniaus padalinys).

XXI amžiaus iššūkis – genų terapija

Dabartiniu metu aktualiausias ir sudėtingiausias DNR karpymo įrankių pritaikymas – genų terapija. Šiuo atveju siekiama gyvoje ląstelėje pakeisti paveldimą ligą lemiantį „blogą“ geną „geru“ genu. Tam reikalingos ypatingu tikslumu pasižyminčios, ilgus DNR taikinius atpažįstančios endonukleazės, kurios DNR kirptų tik reikiamoje žmogaus genomo vietoje, šalia „blogojo“ geno, bet neliestų likusios ląstelės DNR. Ir šioje srityje dirba VU biotechnologai. „Viena mūsų darbo krypčių buvo restrikcijos endonukleazių pritaikymas genų terapijai. Šiam tikslui konstravome restrikcijos fermentų variantus, atpažįstančius pailgintus DNR taikinius, taip pat fermentus, kurių aktyvumą galima būtų „įjungti“ tik šiems prisirišus prie reikiamo taikinio. Ypatingą proveržį šioje genų terapijoje žada neseniai bakterijose atrastos kitos priešvirusinės sistemos, vadinamos CRISPR/Cas, baltymai“, – genų terapijos aktualumą išskiria dr. M. Zaremba. Vadovaujami prof. Virginijaus Šikšnio, šiuos baltymus sėkmingai tiria laureatų kolegos dr. Giedrius Gasiūnas, Tautvydas Karvelis ir Tomas Šinkūnas.

Svarbus vaidmuo atliekant šį mokslo darbą teko bendradarbiavimui su įvairių pasaulio šalių mokslininkais: „Struktūriniai restrikcijos fermentų tyrimai buvo atliekami kartu su kolegomis iš Lenkijos, pavienių baltymų molekulių tyrimai – kartu su Olandijos, JAV, Japonijos mokslininkais, dalis biocheminių tyrimų – kartu su britais ir vokiečiais.“ Dr. G. Sasnauskas, dr. G. Tamulaitis ir dr. M. Zaremba už pagalbą dėkingi ir kolegoms iš VU Biotechnologijos instituto.