Genomo redagavimo technologijos galėtų tapti kur kas pranašesniu įrankiu už šiandien įprastai naudojamus vaistus siekiant išgydyti genetines ir onkologines ligas. Kol kas vienu iš didžiausių barjerų, stabdančių tokių technologijų taikymą, išlieka jų efektyvumas ir pristatymas į tikslines ląsteles. Vilniaus universiteto Gyvybės mokslų centro Baltymų-nukleorūgščių sąveikos tyrimų skyriaus mokslininkas dr. Tautvydas Karvelis kartu su kolegomis gilinasi į TnpB nukleazes ir jų galimą taikymą genomo redagavimui.

Žmogaus genomas – viena didelė knyga

Dr. T. Karvelio teigimu, žmogaus genomą būtų galima prilyginti knygai, sudarytai iš nukleotidų, žymimų raidėmis A, T, G ir C. Pasikeitus vienam nukleotidui – vienai raidei knygoje – įvyksta mutacija, kuri gali lemti ligą.

„Tad esminis klausimas – kaip efektyviai ir tiksliai ištaisyti tą vieną raidę visoje knygoje, nesukeliant nereikalingų papildomų mutacijų kitose vietose. Šiam tikslui naudojamos nukleazės – baltymai, kurie geba tiksliai atpažinti ir perkirpti DNR. Dabartinė genomo redagavimo technologija remiasi tuo, kad mes turime perkirpti genominę DNR kuo arčiau klaidos, kurią norime ištaisyti. Tuomet atsiranda dvigrandininis trūkis ir ląstelė bando jį kuo greičiau „sutaisyti“, pasitelkdama savo vidinius mechanizmus“, – pasakoja mokslininkas.

Mechanizmų, kaip „taisyti klaidas“, ląstelės turi kelis. Vienas jų – tiesiog sujungti abi grandines. Tokio sujungimo vietoje dažnai pridedami ar pašalinami keli nukleotidai, o tai lemia geno „išjungimą“. Šis taisymo būdas gali būti naudingas norint „išjungti“ dėl mutacijos tapusį žalingą geną.

„Norėdami tiksliai ištaisyti mutaciją gene ir atkurti jo funkciją, galime panaudoti kitą ląstelės vidinį mechanizmą: pateikti ląstelei šabloną – labai panašią genominę seką, kurią ląstelė panaudotų „klaidų taisymui“. Taip galime tiksliai pakeisti genominę seką ir ištaisyti mutacijas bei atkurti geno funkciją“, – sako dr. T. Karvelis.

Nukleazės – raktas į genomo redagavimą

Genomo redagavimo principai pasaulyje yra žinomi nuo 1990 m. Ilgą laiką pagrindinė problema buvo ta, kad nebuvo tinkamų įrankių, kaip genomą redaguoti.

„Genomo redagavimo sritis įgavo pagreitį, kai buvo suprasta, kad redagavimui galima panaudoti nukleazes. Iš pat pradžių buvo naudojamos natūraliai gamtoje aptinkamos meganukleazės, vėliau buvo pritaikytos dirbtinės cinko pirštų ir TALE nukleazės. Tačiau tokias nukleazes buvo sunku konstruoti, sunku su jomis dirbti, o ir rezultatas dažnai būdavo nuviliantis, nes tik retu atveju pavykdavo sukonstruoti reikiamas nukleazes“, – sako mokslininkas.

Esminis lūžis įvyko 2013 m., kai buvo parodyta, kad genomo redagavimui galima pritaikyti naujo tipo CRISPR-Cas nukleazes, kurios taikiniui atpažinti panaudoja nukreipiančiąją RNR molekulę. Už šiuos tyrimus 2020 m. buvo paskirta Nobelio premija. Prie šių nukleazių atradimo ir tyrimų svariai prisidėjo ir prof. Virginijaus Šikšnio vadovaujami Lietuvos mokslininkai. „CRISPR-Cas nukleazių skirtumas nuo prieš tai minėtų yra tas, kad labai lengva pakeisti jų specifiškumą – tam užtenka tik pakeisti RNR seką ir jas nukreipti efektyviai kirpti tas sekas, kurias mes norime. Būtent CRISPR-Cas pritaikymas genomų redagavimui lėmė, kad ši sritis ėmė sparčiai vystytis. Šiuo metu yra plačiai atliekami klinikiniai tyrimai, o prieš kelias dienas jau buvo patvirtintas ir pirmasis CRISPR-Cas nukleaze paremtas vaistas, skirtas paveldimoms kraujo ligoms gydyti“, – pasakoja tyrėjas.

Nors dr. T. Karvelio tyrimai prasidėjo nuo CRISPR-Cas nukleazių, tačiau mokslininkas su kolegomis šiuo metu daugiausia dėmesio skiria kiek kitokių, TnpB nukleazių moksliniams tyrimams. TnpB yra naujos klasės genų žirklės, susijusios su mobiliais genomo elementais – transpozonais. Tai yra mažiausios iki šiol žinomos nukleazės.

„Atliekant CRISPR-Cas sistemų tyrimus buvo pastebėta, kad vienas iš transpozonuose aptinkamų baltymų yra TnpB. Šis baltymas yra itin mažas ir buvo spėjama, kad tai pirminis baltymas, iš kurio vykstant evoliucijai išsivystė daug didesnės CRISPR-Cas nukleazės. Mums buvo įdomu, kokią funkciją atlieka šie TnpB transpozonuose aptinkami baltymai. Atlikę tyrimus nustatėme, kad, panašiai kaip ir CRISPR-Cas nukleazės, TnpB baltymai yra nukleazės, kurios gali veikti žmogaus ląstelėse ir būti pritaikytos efektyviam genomo redagavimui“, – pasakoja mokslininkas.

TnpB nukleazių privalumai

CRISPR-Cas nukleazės yra santykinai dideli baltymai. Iškyla problema, kaip šiuos baltymus nugabenti į ląsteles, kur jie atliktų savo darbą – galėtų perkirpti genominę DNR reikiamoje vietoje.

„Šiuo metu yra taikomi du pagrindiniai būdai. Pirmas – panaudoti adeno asocijuotais virusais paremtus vektorius, kurie veikia kaip nešikliai ir nugabena nukleazę į ląsteles. Kitas būdas yra mėgintuvėlyje susintetinti koduojančią RNR, ją „supakuoti“ į lipidines nanodaleles ir taip pristatyti į ląsteles. Abu šie pristatymo metodai buvo anksčiau pritaikyti klinikoje kitų baltymų pristatymui į ląsteles. Taikant abu šiuos būdus, viena iš kliūčių yra per didelis nukleazių dydis“, – pasakoja mokslininkas.

TnpB nukleazės šiuo atveju yra daug pranašesnės, nes jos yra labai mažos – iki trijų kartų mažesnės nei CRISPR-Cas, tad jas lengviau pristatyti į ląsteles. Kitas TnpB pranašumas – didelė jų įvairovė gamtoje.

„Gamtoje yra daug skirtingų CRISPR-Cas nukleazių, tačiau TnpB nukleazių paplitimas ir įvairovė kur kas didesni. Tai potencialus įrankių šaltinis ieškant aktyvesnių ir mus dominančiomis specifinėmis savybėmis pasižyminčių nukleazių“, – sako dr. T. Karvelis.

Dr. Tautvydas Karvelis. Asmeninio archyvo nuotr.

TnpB nukleazės leidžia patobulinti augalus ir padėtų naikinti vėžines ląsteles

Mokslininkas pasakoja, kad proveržis genomo redagavimo srityje įvyko atradus CRISPR-Cas nukleazes. Būtent tai lėmė didelį susidomėjimą šia sritimi ir daugybę šiuo metu vykstančių klinikinių tyrimų, kuriais siekiama šias nukleazes panaudoti įvairioms ligoms gydyti. Tad visur, kur yra taikomos CRISPR-Cas nukleazės, galėtų būti pritaikytos ir TnpB.

„Šios nukleazės galėtų būti taikomos tiek genetinėms ligoms, tiek onkologiniams susirgimams gydyti. Šiandien jau yra žinoma CAR-T technologija, kuri leidžia ląsteles modifikuoti taip, kad jos atpažintų vėžines ląsteles ir jas sunaikintų. Tad tiek CRISPR-Cas, tiek TnpB nukleazės gali būti naudojamos siekiant sukurti tokių ląstelių inžineriją“, – pristato mokslininkas.

Kita sritis, kurioje būtų galima taikyti šias genomo redagavimo technologijas, yra žemės ūkis.

„Panaudojant nukleazes galima daug greičiau, paprasčiau ir kryptingiau nei taikant selekciją pagerinti žemės ūkyje auginamus augalus, kurie būtų atsparesni klimatinėms sąlygoms (galėtų augti regionuose, kur dabar sunku juos užauginti) ir įvairioms ligoms. Gyvulininkystės srityje tokių nukleazių taikymas galėtų leisti pašalinti alergenus ir sudarytų sąlygas plačiau vartoti tokius produktus“, – sako mokslininkas.

Šiandien genomo redagavimo technologijos yra plačiai taikomos žemės ūkyje, o prieš kelias dienas Jungtinėje Karalystėje buvo patvirtintas pirmasis vaistas paveldimoms kraujo ligoms gydyti.

„Pasaulyje yra nemažai mokslininkų grupių, kurios CRISPR-Cas nukleazes naudoja augalams tobulinti. Vyksta daug klinikinių tyrimų su žmonėmis, kuriems buvo taikomas gydymas su šiomis nukleazėmis, ir jų rezultatai yra teigiami. Jau yra patvirtintas pirmasis vaistas, paremtas šiomis nukleazėmis. Tai tikrai rodo didelį šių genomo redagavimo technologijų potencialą“, – pasakoja dr. T. Karvelis.

Norint plačiau pritaikyti nukleazes, dar reikia įveikti keletą iššūkių

Siekiant plačiai taikyti genomo redagavimo technologijomis paremtus vaistus, dar teks įveikti keletą iššūkių. Tarp jų – kai kuriais atvejais per mažas aktyvumas ir per mažai efektyvus pristatymas į ląsteles. Prie šių problemų sprendimo galėtų prisidėti ir TnpB nukleazių panaudojimas.

„Nors mums pirmiesiems pavyko parodyti, kad TnpB nukleazės yra efektyvios ir gali būti pritaikytos genomo redagavimui, bet dar yra erdvės tą efektyvumą padidinti“, – sako mokslininkas.

Vis dėlto daug svarbesnis kriterijus, kalbant apie genomo redagavimo technologių taikymą, yra jų saugumas.

„Vykdant klinikinius tyrimus labai svarbu išsiaiškinti, kiek šios nukleazės yra saugios žmogui ir ar nesukelia šalutinių poveikių. Svarbu suprasti, kad genomo redagavimo technologijomis paremti produktai yra visiškai naujo tipo, tad yra labai kruopščiai tikrinamas jų saugumas, tačiau iki šiol gauti rezultatai nuteikia labai optimistiškai“, – pasakoja mokslininkas.

Dr. T. Karvelis sako, kad sunku rasti mokslinę sritį, kurioje per tokį trumpą laiką viskas taip sparčiai vystytųsi: „Per pastaruosius 10 metų genomo redagavimo technologija labai smarkiai patobulėjo. Norisi tikėti, kad po dar 10 metų jau turėsime plačiai visiems prieinamus vaistus, kurie padėtų daugeliui žmonių įveikti genetines ir onkologines ligas. Reikia suprasti, kad tokių vaistų kūrimas yra labai brangus ir sudėtingas procesas, bet tikimės, kad nuolatos kaupiamos žinios ir įgyjama patirtis padės pagreitinti ir supaprastinti šį procesą. Šiuo metu mūsų tikslas – įveikti mokslinius iššūkius ir sukurti kaip įmanoma geresnius ir efektyvesnius TnpB nukleazėmis paremtus įrankius genomui redaguoti.“