Vilniaus universiteto Gyvybės mokslų centro docentė Eglė Lastauskienė su kolegomis iš Vilniaus Gedimino technikos universiteto, Gamtos tyrimų centro ir Inovatyvios medicinos centro kelerius metus ieškojo alternatyvų, kaip išgydyti odos ligas, ypač dažną kandidozę, nenaudojant cheminių vaistų. Nors tyrimai buvo atlikti imitavus kosmoso aplinką, tačiau gauti rezultatai gali užkirsti kelią žmones kamuojančioms odos ligoms.

Lietuvos mokslininkai vieni pirmųjų pasaulyje elektroporacijos metodą panaudojo mikrogravitacijos sąlygomis odos patogenuose sukelti apoptozę (programuotą ląstelių žūtį, kuri neskatina uždegimo ir nepakenkia audiniams), taip pat sukūrė naujos kartos, pasaulyje analogų neturinčią, hibridinę didelės galios magneto-elektroporacijos sistemą.

Ieškojo, kaip priversti ląsteles pačias nusižudyti

Kaip aiškina mikrobiologė doc. E. Lastauskienė, odos infekcijos prasideda po antibiotikų terapijos, autoimuninių ligų ar odos alerginių reakcijų sutrikus natūraliai mikroflorai. Išnykus gerosioms mūsų organizmo bakterijoms jų vietoje apsigyvena stipresni mikroorganizmai, dažniausiai Candida genties mieliagrybiai: šie grybeliai pradeda vešėti tada, kai nebelieka natūralių konkurentų. Po antibiotikų vartojimo mūsų oda tampa itin sterili, joje nebėra gerosios mikrofloros, tad ant jos pradeda augti antibiotikams atsparios mielės.

Mielių Saccharomyce cerevisiae ląstelės, nudažytos fluorescenciniais DAPI, FITC ir PI dažais. Fluorescencinės mikroskopijos nuotrauka, padidinta 1000 kartų. Doc. E. Lastauskienės nuotr.

„Tuomet oda pradeda luptis. Gydant kandidozę jos sukėlėjo ląstelė pakeičia formą, formuoja pseudohifus ir pasislepia gilesniuose odos sluoksniuose. Taip susidaro antriniai infekcijos židiniai ir gydymas tampa sudėtingas. Jeigu ląstelė žūva dėl apoptozės, t. y. vykstant programuotai žūčiai, ji susitvarko su savo turiniu, tvarkingai supakuojami ir degraduojami baltymai, nukleorūgštys ir kitos molekulės. Apoptozė būna griežtai programuota: genai, atsakingi už šios programos įvykdymą, po truputį sukarpo visą ląstelės turinį iki mažų molekulių. Tuomet arba mūsų makrofagai, arba epitelio ląstelės gali pasisavinti tuos junginius ir juos panaudoti regeneracijai“, – apoptozės pranašumus dėsto mokslininkė.

Tačiau ląstelės gali žūti ir nekrozės būdu. Tokiu atveju ląstelė susprogsta, o jos turinys (pažeisti baltymai), įvairios netaisyklingai sulankstytos ar toksinės molekulės tiesiog pasklinda po mūsų audinius. Dėl to mokslininkai siekė surasti apoptozę galinčias sukelti savybes.

Kai prabunda „tylinčios“ infekcijos

Odos infekcijų problema kosminėje aplinkoje dar aktualesnė ir sudėtingesnė. Pasak doc. E. Lastauskienės, kosmose pakinta tiek paties žmogaus fiziologija, tiek jo imuninis atsakas į įvairias ligas. Netgi buvo pastebėta, kad visos „tylinčios“ bakterinės ar virusinės infekcijos, kurios įprastai nepasireikštų, į aktyvią formą ima pereiti būtent mikrogravitacinėje aplinkoje, kurioje veikia ir labai didelė spinduliuotė. Kai „tylinčios“ infekcijos prabunda, su jomis kovoti pasidaro itin sunku.

„Žinoma, antibiotikai ir tradicinės gydymo priemonės padėtų, bet šių junginių vartojimas kosmose ribotas, o to paties vaisto poveikis žemėje ir kosmose gali būti skirtingas. Kosmose cheminių junginių vartojimui taikomos labai griežtos taisyklės. Todėl pasirinkome ieškoti būdų, kaip išspręsti tokias problemas, kaip sumažinti cheminių junginių dozes arba išvis jų atsisakyti ir galbūt kai kuriais atvejais pereiti prie kitokių kovos su infekcijomis būdų. Grybelinės infekcijos kelia daug problemų, Candida genties mieliagrybiai yra komensalai. Tai reiškia, kad jie gyvena ant mūsų odos. Pasikeitus organizmo balansui ir išnykus gerajai mikroflorai Candida genties mieliagrybiai ima kolonizuoti suaugusio žmogaus organizmą“, – pasakoja mikrobiologė.

2017 m. duomenimis, 75 proc. populiacijos yra bent kartą gyvenime turėję Candidą. Dažniau ji paplitusi moterų lytiniuose takuose. Ši infekcija atsinaujina daugiau nei 50 proc. žmonių. Žinoma daug šio mieliagrybio rūšių: lytiniuose takuose aptinkama Candida albicans, ant nagų, odos auga kitos Candidos: C. lusitaniae, C. Guilliermondii, C. Parapsilosis. Su šiais mikroorganizmais kovoti sunkiau todėl, kad jų ląstelės struktūra panaši į žmogaus ląstelės, abu priskiriami eukariotams. Vienintelis skirtumas – mūsų ląstelės neturi sienelės, šiek tiek skiriasi membranų sudėtis. Žmogaus ląstelių membranose yra cholesterolio, kitokių lipidų, o grybinėse membranose aptinkama daugiau ergosterolio. Dauguma vaistų nuo mieliagrybio nukreipti būtent į ergosterolį: arba kad jo nesintetintų, arba kad jį iš membranų pašalintų padarydami poras, kas lemia ląstelės žūtį. Jeigu bandome sustabdyti ergosterolio sintezę, stabdome ir mūsų ląstelėse esančių tam tikrų sterolių jungimąsi. Vaistai, skirti mieliagrybiui Candida gydyti, pasižymi dideliu pašaliniu poveikiu: gali sukelti alergines reakcijas, odos nusilupimą, pleiskanojimus ar net pažeisti kepenis. Tai dažniausiai sukelia geriamieji priešgrybeliniai junginiai. Tokiu atveju gydytojai papildomai skiria kepenų fermentų tyrimus. Todėl mūsų šalies mokslininkai kaip alternatyvą priešgrybeliniams junginiams pradėjo taikyti elektroporaciją.

Metodą galima taikyti ne tik kosmose

Pseudomonas aeruginosa ląstelė, pažymėtos skirtingais fluorochromais. Nuotrauka padidinta 1000 kartų.

Elektroporacija – tai metodas, kai pulsuojantis elektrinis laukas pritaikomas ląstelei pažeisti. Elektroporacijos metu ląstelės membranoje atsiveria poros. Jos gali būti laikinos arba amžinos. Tai, per kiek laiko užsidarys poros, priklauso nuo mikroorganizmo. Jeigu poros užsidaro, ląstelė išgyvena. Priešingu atveju ji žūva. Galima pritaikyti labai stiprius impulsus ir priversti visas ląsteles numirti, bet tai paveiks ir mūsų organizmą. Vadinasi, tokia sistema netinkama. Todėl reikia ieškoti tokių parametrų ir tokių junginių, kurie leistų nužudyti patogeną, bet paliktų mūsų audinius sveikus. Lietuvos mokslininkų tyrimas susidėjo iš trijų dalių: optimalių elektroporacijos parametrų paieškų, apoptozės indukavimo ir in vivo tyrimų su pelėmis. Pastaruosius atliko prof. Irutė Girkontaitė iš Inovatyvios medicinos centro. Doc. E. Lastauskienė pasakoja, kad pelė būdavo užkrečiama Pseudomonas aeruginosa – bakterija, kolonizuojančia odą. Į ją papildomai buvo įvesta plazmidė su liuciferazės genu, kas leido stebėti švytėjimą. Žaizdoms elektroporuoti Vilniaus Gedimino technikos universiteto mokslininko doc. Vitalijaus Novickio grupė sukūrė specialius elektrodus, kuriuos galima priliesti prie odos, žaizdos kraštų. Tyrėjai stebėjo, kaip Pseudomonas aeruginosa švytėjimas po elektroporacijos gęsta, t. y. kaip žūva bakterijos, ir kokių reikėtų parametrų, kad sistema efektyviai veiktų.

Candida lusitaniae ląstelė, pažymėta skirtingais fluorochromais. Nuotrauka padidinta 1000 kartų.

„Turbūt daugelis įsivaizduoja, kad odos infekcija yra paprastas dalykas: pabėrė ar atsirado žaizda, kuri po kažkiek laiko užgyja. Žinome tokių pacientų, kuriems žaizdos negyja metais. Jau yra buvęs atvejis, kai taikant elektroporaciją vienam pacientui trejus metus negijusi žaizda sugijo. O vienai pacientei ant visos odos augo mieliagrybiai, tad ji galėjo praustis tiktai vandeniu su soda. Tai rodo, kad mūsų atliekami tyrimai pritaikomi ne vien kosmose“, – argumentuoja mikrobiologė ir priduria, kad mikrogravitacijos sukūrimas taip pat leidžia atrasti tokius mikroorganizmų fenotipus, kurių mokslininkai greičiausiai niekada nebūtų pastebėję juos augindami įprastinėje aplinkoje, o tai galėtų paaiškinti sudėtingų infekcijų ir mikroorganizmų atsiradimą.

„Atradę superfenotipą galbūt žinotume, kokie genai įsijungė, kas nutiko, kad mieliagrybis taip pakeitė savo fiziologiją, ir ką reikėtų daryti, kad jį pašalintume“, – sako doc. E. Lastauskienė. Nors elektroporacija užsienyje jau taikoma, tačiau pirminė jos funkcija – vėžio gydymas. Mūsų šalies tyrėjai vieni pirmųjų pasaulyje elektroporaciją pritaikė odos ligoms gydyti. Šis metodas padėtų didžiajai populiacijos daliai, kurią kamuoja atopinis dermatitas, nes juo sergančių žmonių mikroflora pažeista visą laiką. Taikant elektroporaciją būtų galima bent jau išvengti odą kolonizuojančių patogeninių mikroorganizmų.

Mikrogravitacijos sąlygomis išaugęs atsparumas

Tam, kad būtų galima simuliuoti mikrogravitacijos sąlygas žemės aplinkoje, Vilniaus universiteto Gyvybės mokslų centro mokslininkai naudojo ląstelių rotacinę kultivavimo sistemą, kuri pirkta iš įmonės, gaminančios įrangą NASA‘i. Šiame įrenginyje ląstelės sukasi vertikaliai. Vertikalus judesys lemia, kad ląstelė visą laiką yra laisvo kritimo būsenos ir nebejunta žemės traukos. Doc. E. Lastauskienės teigimu, viena teorijų sako, kad esant vertikaliam rotaciniam judesiui maisto medžiagos aplink ląstelės paviršių pasiskirsto tvarkingai ir tolygiai, ji gauna daugiau maisto medžiagų, todėl geriau auga.

„Bandėme išsiaiškinti, ar ląstelės atsparesnės tam tikroms medžiagoms, ar pasidaro atsparesnės pačiai elektroporacijai. Visos ląstelės fiziologijos pakitimas reiškia, kad greičiausiai turėtų būti įterpti didesni atsparumo genai, tačiau gali būti, kad ląstelės taps jautresnės. Tyrimų yra, bet jie gana prieštaringi. Vieni teigia, kad ląstelės atsparumas padidėja, kiti – kad sumažėja. Išeina taip, kad vienoms medžiagoms atsparumas didesnis, kitoms – mažesnis. Tačiau esame pirmieji pasaulyje, aprašę mikrogravitacijos poveikį atsparumui tokiems fizikiniams stresams kaip elektroporacija“, – patikina mikrobiologė. Ji viliasi, kad ląstelių rotacinė kultivavimo sistema leis sužinoti, kaip išsivysto itin atsparūs fenotipai.

Žinoma, kad Candidai iš apvalios ląstelės formos perėjus į pseudohifų formą smarkiai padidėja jos atsparumas. Gyvybės mokslų centro Eukariotų molekulinės mikrobiologijos laboratorijos mokslininkai nustatė, kad po auginimo rotacinėje kultivavimo aplinkoje mielių atsparumas antibiotikui nuo 10 kartų išaugo iki 32 kartų. Todėl mokslininkai toliau ketina analizuoti itin atsparius fenotipus genetiniu lygmeniu.