Tyrimų metu Vilniaus universiteto laboratorijoje

Prieš trejus metus pandemiją pasaulyje sukėlęs koronavirusas jau taip nebegąsdina žmonijos. Pastaruoju metu ėmė vyrauti nuomonė, kad nebereikia nerimauti dėl COVID-19, nors jis niekur nedingo, keičiasi tik jo atmainos. Šį rugsėjį Jungtinėje Karalystėje buvo aptikta nauja COVID-19 atmaina, kuriai buvo suteiktas vardas Pirola.

Pagrindinį vaidmenį kovoje su koronavirusu tiek pandemijos metu, tiek dabar atlieka įvairios diagnostikos metodikos – nuo PGR testų iki šoninio srauto analizės ir pažangiausių biojutiklių. Koronavirusui ir toliau metant iššūkį pasauliui, vykstantys biosensorinių technologijų tyrimai teikia vilties ir atskleidžia nepaprastą žmonių bendradarbiavimo gebėjimą įveikiant pasaulines sveikatos krizes.

Pandemija paskatino mokslinį bendradarbiavimą ir inovacijas. Viena iš pagrindinių tyrimų sričių – diagnostikos metodikų tobulinimas. Norint patobulinti tyrimo metodikas, labai svarbu suprasti koronaviruso struktūrą ir tai, kas vyksta žmogaus organizme užsikrėtus. Koronaviruso pavadinimas kilęs dėl apvalios šio viruso formos ir ant viruso paviršiaus esančių spyglio baltymų, sukuriančių karūnos ar vainiko įvaizdį. Dėl šių paviršiuje esančių spyglio baltymų virusas gali prisijungti prie žmogaus ląstelių ir vėliau patekti į jas. Viruso viduje yra genetinė medžiaga, žinoma kaip ribonukleino rūgštis (RNR), kuri yra apsaugota riebaliniu, į apvalkalą panašiu išoriniu sluoksniu. Viruso genetinė medžiaga patenka į ląstelę ir pradeda daugintis, o išplitusi virusinė infekcija galiausiai sukelia COVID-19 simptomus užsikrėtusiam asmeniui.

Tyrimų metu Vilniaus universiteto laboratorijoje

Virusui patekus į kūną, mūsų imuninė sistema atpažįsta jį kaip svetimą įsibrovėlį. Kad galėtų kovoti su virusu, imuninė sistema turi specialias ląsteles, gaminančias baltymus, žinomus kaip IgG ir IgM antikūnai, kurie padeda mus apsaugoti nuo svetimkūnių. IgM antikūnai yra vieni pirmųjų imuninės sistemos atsakų. Pirmą kartą užsikrėtus SARS-CoV-2, imuninė sistema pradeda sparčiai gaminti IgM antikūnus kovai su virusu. Tuo tarpu IgG antikūnai užtikrina vėlesnį ir stipresnį imuninės sistemos atsaką. Šie antikūnai išlieka organizme ilgą laiką, net ir pasveikus nuo infekcijos, todėl, antrą kartą užsikrėtus tuo pačiu virusu, COVID-19 simptomai arba nepasireiškia, arba sergama daug trumpiau ir lengviau.

SARS-CoV-2 virusas

Kuo skiriasi COVID-19 diagnostiniai testai?

Šiuo metu visuomenei yra prieinami COVID-19 diagnostikos metodai, skirti SARS-CoV-2 RNR, spyglio baltymams ir antikūnams prieš SARS-CoV-2 aptikti. Atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininės reakcijos (AT-PGR) testas iš tiesų laikomas auksiniu standartu nustatant SARS-CoV-2. Dėl didelio tikslumo ir jautrumo jis yra plačiai naudojamas diagnostikoje aktyvioms infekcijoms aptikti. AT-PGR testui atlikti paimamas gleivių mėginys iš nosiaryklės, kuriame yra viruso RNR. Šis mėginys kaitinamas iki aukštos temperatūros, šiluma suardo SARS-CoV-2 viruso apvalkalą ir atskiria jo RNR nuo kitų komponentų. Tada atvirkštinės transkriptazės fermentas pakeičia RNR į jai komplementarią DNR. Po to vykdomas „terminis ciklas“, apimantis daug kartų pasikartojančius denatūravimo ir kaitinimo etapus, siekiant padauginti (amplifikuoti) viruso genetinę medžiagą naudojant DNR polimerazės fermentus, skirtus susintetinti naujas DNR grandines. Jei mėginyje buvo didelis viruso RNR kiekis, AT-PGR reakcija po pasirinkto „terminių ciklų“ skaičiaus lemia reikšmingą viruso genetinės medžiagos padauginimą (amplifikaciją), o jei mėginyje viruso RNR nebuvo, AT-PGR reakcijos nevyksta ir DNR nesusidaro. Viruso kiekiui mėginyje po AT-PGR reakcijos nustatyti naudojamas specialus fluorescuojantis dažiklis, kuris švyti, kai prisijungia prie susidariusios DNR.

COVID-19 testai

Šoninio srauto analizė (ŠSA) yra kitas testo tipas, naudojamas aktyviai SARS-CoV-2 infekcijai aptikti. Mėginys, kuriame gali būti viruso dalelių, kapiliariniu būdu migruoja išilgai ŠSA tyrimo juostelės. Juostelė susideda iš skirtingų dalių, kurių kiekvienoje yra integruoti tam tikri testui skirti komponentai. Mėginiui judant per tyrimo juostelę, jis sąveikauja su įvairiais specifiniais antikūnais, imobilizuotais tam tikroje juostelės vietoje. Šie antikūnai yra sukurti taip, kad atpažintų spyglio baltymą ir kitas SARS-CoV-2 viruso dalis. Analizuojamam mėginiui dėl kapiliarinių jėgų, judant išilgai tyrimo juostelės, SARS-CoV-2 virusas ir jo dalys gali susijungti su juostelėje imobilizuotais antikūnais. Kai tai įvyksta, tam tikroje juostelės vietoje išryškėja „bandymo linija“, kurią ir matome. Rezultatai įvertinami po to, kai mėginys sudrėkina visą tyrimo juostelę. Jei mėginyje matoma ir tyrimo linija, ir kontrolinė linija, tai COVID-19 testas yra vertinamas kaip „teigiamas“ ir parodo, kad asmuo serga COVID-19. Bet jeigu mėginyje matoma tik kontrolinė linija, tuomet COVID-19 testo rezultatas yra neigiamas. ŠSA metodas taip pat yra naudojamas IgG ir IgM antikūnams prieš SARS-CoV-2 aptikti. Šiuo atveju tyrimo juostelės vietose yra integruotos specifinės SARS-CoV-2 viruso dalys (antigenai). Šie antigenai yra sukurti taip, kad prisijungtų tik prie SARS-CoV-2 antikūnų, randamų kraujo mėginyje. Šis greitasis antikūnams nustatyti skirtas ŠSA testas, palyginti su anksčiau išvardytais tyrimo metodais, gali diagnozuoti tiek infekciją „aktyvios fazės“ metu, tiek ir infekcijai pasibaigus. Šis metodas įgalina įvertinti specifinių antikūnų koncentracijas ir organizmo imuninės sistemos atsako į infekciją stiprumą.

Elektrocheminis biojutiklis, skirtas SARS-CoV-2 RNR aptikti. Šioje analizinėje sistemoje yra panaudotas biologinio atpažinimo elementas, tikslinės RNR fragmentas ir žyminčios RNR fragmentas, RNR hibridizacija

Kaip veikia biojutikliai diagnozuojant COVID-19?

Dėl gebėjimo aptikti specifinius viruso komponentus pacientų mėginiuose biojutikliai tapo svarbiomis SARS-CoV-2 diagnostikos priemonėmis. Biojutikliai yra gaminami naudojant biologines medžiagas, kurios tarnauja kaip atpažinimo elementai, pavyzdžiui, antikūnai ar antigenai. Šių medžiagų sąveiką su konkrečiomis tikslinėmis analitėmis galima registruoti įvairiais analiziniais metodais. Elektrocheminiai biojutikliai yra plačiai naudojami, nes yra itin jautrūs, aptinka net nedidelius tikslinės analitės kiekius. Be to, šie jutikliai pasižymi trumpa analizės trukme. Pavyzdžiui, elektrocheminis biojutiklis gali būti naudojamas SARS-CoV-2 RNR aptikti, remiantis RNR hibridizacijos su juos papildančiomis grandinėmis principu. Biojutiklio biologinio atpažinimo elementas apima tikslinės RNR užfiksavimą. Biojutiklyje taip pat yra analitinis signalo keitiklis, kuris atpažinimo įvykį paverčia išmatuojamu elektriniu signalu. Šis veikimo principas pagrįstas hibridizacijos atpažinimu, kuris atsiranda, kai dvi viena kitą papildančios RNR grandinės susijungia ir sudaro dvigrandę struktūrą. Tikslinei RNR aptikti gali būti naudojami papildomai žymėti RNR fragmentai. Šie RNR fragmentai padeda sustiprinti signalą ir padidinti biojutiklio jautrumą. Hibridizacijos procesas gali vykti ant elektrodo paviršiaus arba tirpale. Kai tikslinė RNR prisijungia prie elektrodo, pasikeičia elektrocheminės savybės, todėl susidaro elektrinis signalas. Tada šis signalas išmatuojamas ir kiekybiškai įvertinamas, kad būtų galima aptikti ir kiekybiškai įvertinti tikslinės RNR koncentraciją mėginyje.

Elektrocheminis molekuliniu būdu įspaustų polimerų biojutiklis, skirtas SARS-CoV-2 baltymams aptikti

Elektrocheminiai biojutikliai taip pat gali būti naudojami SARS-CoV-2 baltymams ir antikūnams aptikti. Mūsų darbo grupė ypač aktyviai užsiima šios srities tyrimais. Vienas jų – molekuliniu būdu įspaustų polimerų (MIP) naudojimas SARS-CoV-2 baltymams aptikti. Šis metodas leidžia kurti elektrocheminius biojutiklius, kurie veikia komplementaraus („rakto ir spynos“) atpažinimo principu. Biojutiklis yra padengiamas elektrai laidžiu polimeru, kuriame galima suformuoti viruso įspaudus. Šie įspaudai yra tarsi mažos ertmės, kurių geometrija ir finkcinių grupių išsidėstymas idealiai atitinka viruso spyglio baltymo geometriją ir funkcinių grupių išsidėstymą. Mėginiui patekus ant tokio biojutiklio, mėginyje esantys spyglio baltymai įstringa šiose ertmėse ir sukelia biojutiklių elektrocheminių ir/arba kitų fiziko-cheminių savybių pokyčius. Šis elektrinio signalo pokytis leidžia aptikti ir išmatuoti mėginyje esančio baltymo kiekį, o tai padeda diagnozuoti COVID-19 infekciją, pritaikyti tinkamą gydymą, kuris sušvelnina virusinės infekcijos poveikį.

Elektrocheminis biojutiklis, padengtas savitvarkiu monosluoksniu, skirtas antikūnams prieš SARS-CoV-2 spyglio baltymus aptikti

Vykdydama bendrą Lietuvos, Latvijos ir Taivano projektą „Flow-through System Based Immunoanalytical Devices for the Diagnosis of Viral-infections“ (vadovas prof. Arūnas Ramanavičius) ir bendradarbiaudama su Latvijos ir Taivano mokslininkais, VU mokslinė grupė šiuo metu kuria elektrocheminius biojutiklius, skirtus antikūnams prieš SARS-CoV-2 virusą aptikti. Šie biojutikliai yra padengiami savitvarkiu monosluoksniu (SAM), kuris sudaro „lipnų“ paviršių, galintį „pagauti“ ir kovalentiškai prijungti SARS-CoV-2 spyglio baltymus. Ant tokio modifikuoto biojutiklio paviršiaus užnešus mėginį, kuriame yra antikūnų prieš SARS-CoV-2 virusą, jie gali jungtis prie biojutiklyje imobilizuotų spyglio baltymų. Šis prisijungimas sukelia biojutiklio elektrocheminių ir / arba kitų fizikinių savybių pokyčius, kurie gali būti registruojami tinkamai parinktais metodais. Registruojamo signalo stiprumas yra tiesiogiai susijęs su antikūnų koncentracija mėginyje. Matuojant šį signalą, galima aptikti ir kiekybiškai įvertinti specifinių SARS-CoV-2 antikūnų koncentraciją mėginyje.

Mokslo pažanga ir bendradarbiavimo pastangos lėmė reikšmingą proveržį kuriant naujoviškus šio viruso diagnostikos metodus. Nuolatiniai biojutiklių technologijų tyrimai ir inovacijos padeda padeda sušvelninti koronaviruso infekcijos poveikį.