Personalizuotai medicinai įgaunant vis didesnį pagreitį, laboratorijose vykdomi moksliniai tyrimai persikelia į pačių mažiausių gyvybės vienetų – ląstelių aplinką.

„Kiekviena ląstelė yra skirtinga. Pavyzdžiui, kamieninės ląstelės dalinasi, įgauna naujas funkcijas ir tampa odos, raumenų ir kitomis ląstelėmis. Įdomu, kad net ir tos pačios rūšies ląstelės yra skirtingos. Tad siekiant sužinoti procesus, kurie vyksta ląstelėse, reikia stebėti pavienes ląsteles arba, dar geriau, pavienes molekules“, – sako Vilniaus universiteto (VU) Gyvybės mokslų centro (GMC) Biotechnologijos instituto mokslininkas doc. Marijonas Tutkus. Jis kartu su kolegomis tobulina DNR užuolaidų platformą ir superrezoliucijos (ypač aukštos skiriamosios gebos) mikroskopijos sistemą, kuri su šia platforma tampa ypač galingu įrankiu.

Fluorescencinė mikroskopija leidžia tyrinėti net pavienes molekules

Šviesos mikroskopijos metodą daugelis iš mūsų esame išbandę dar mokykloje. Jo metu objektą matome todėl, kad mikroskopas geba jį padidinti, o kontrastą matome todėl, kad šviesa skirtingai sąveikauja su skirtingomis objekto dalimis. Tačiau ši optinė mikroskopija yra ribota įprastų parametrų. Doc. M. Tutkaus pasakoja, kad, norėdami įvertinti biomolekulių struktūrą ir jų funkcijas, mokslininkai pasitelkia fluorescencinę mikroskopiją.

„Fluorescencinė mikroskopija išsiskiria iš kitų mikroskopijos rūšių tuo, kad leidžia pamatyti pačius smulkiausius gyvybę sudarančius darinius gyvose ląstelėse ir tyrinėti jų dinamiką – pavienes molekules. Standartinės biomolekulės yra kelių dešimčių nanometrų dydžio, tad įprastu mikroskopu matytume tik molekulių sankaupas. Mūsų naudojama fluorescencinė mikroskopija leidžia aptikti ir sekti pavienes molekules, o tai leidžia sužinoti jų struktūrą ir funkciją“, – sako tyrėjas.

Fluorescencinė mikroskopija yra nedestruktyvus metodas ir, tinkamai vykdoma, visiškai nekenkia net pavienėms ląstelėms. Šis metodas gali būti pritaikytas ir ląstelėms, ir audiniams, ir molekulėms tirpale tyrinėti. Fluorescencinė mikroskopija pirmiausia veikia kaip žymėjimo būdas. Šviesą skleidžiančiomis molekulėmis (fluoroforais) mokslininkai pažymi tikslines molekules, kurias nori stebėti.

„Jeigu bandinį apšviesime viena spalva, pažymėtos molekulės skleis kiek kitokią spalvą. Šviesą, kurią naudojame bandiniui sužadinti, galime užblokuoti optiniais filtrais ir palikti tik fluorescencinės molekulės skleidžiamą šviesą. Optinėje mikroskopijoje negalime foninės šviesos taip paprastai užblokuoti, o fluorescencinėje mikroskopijoje mes išryškiname tik tą molekulę, kurią norime sekti ir tirti“, – pasakoja doc. M. Tutkus.

Norint tirti pavienes molekules, neužtenka jų pažymėti. Dažnai nutinka taip, kad pažymėtos molekulės yra per daug arti viena kitos ir siekiant jas „atskirti“ būtina naudoti superrezoliucijos metodą.

„Dėl superrezoliucijos metodo galime pasižymėti molekules specifiniais dažais, o dėl fluorescencinės mikroskopijos žiūrėti, kaip molekulės sąveikauja. Kitaip tariant, galiu knistis šieno kupetoje ir matyti tik tą vieną pažymėtą molekulę, nematydamas šiaudų aplinkui. Tad šią ląstelę matome būtent dėl superrezoliucijos ir galime tiksliai pasakyti, kokioje vietoje ji yra kokiu metu. Sudėtingiausia yra nustatyti, kaip sužadinti vieną molekulę vienu metu ir kitą molekulę kitu metu, kad tyrinėjant jos nepersidengtų“, – pasakoja mokslininkas.

Doc. Marijonas Tutkus. Asmeninio archyvo nuotr.

Siekiama pagerinti „DNR užuolaidų“ metodą

Norint aptikti ir tyrinėti tokius mažus objektus kaip biomolekulės, reikia pasitelkti ne tik  fluorescencinę mikroskopiją, leidžiančią matyti labai mažus objektus, bet ir tam skirtas platformas. Dėl šių platformų pavyksta „pagauti“ ir imobilizuoti ant paviršiaus norimas molekules, o tuomet įvertinti jų sąveiką su kitomis molekulėmis.

„Mokslininkai siekia tirti gana ilgas DNR molekules, nes tokios yra mūsų genomuose. Bet, imobilizavus šias molekules ant paviršiaus, jos „sukrenta“ ir nebematome jų sąveikos. Tad molekules reikia ištempti, naudojant buferio tėkmę. Tam pasitelkiamas „DNR užuolaidų“ metodas. Man pačiam šias „DNR užuolaidas“ lengviau įsivaizduoti kaip žoles upėje. Jeigu žolė ilga, ji įsikabina į dugną ir upės tėkmė ją ištempia. Tuomet ta žolė atrodo kaip įsitempusi styga. Panašiai vyksta ir su imobilizuotomis molekulėmis, kurias tiriame DNR užuolaidų metodu“, – sako tyrėjas.

Tad jeigu tokią išsitempusią DNR molekulę pažymime tam tikrais dažikliais, galime matyti individualias molekules. Tuomet galima pridėti kita spalva nudažytą baltymą ir sekti, kuriose vietose tas baltymas jungiasi.

„Atlikdami eksperimentą DNR užuolaidų metodu matome 100 DNR molekulių ir tūkstančius baltymų, kurie jungiasi skirtingose vietose. Tad vieno eksperimento metu galime charakterizuoti visą molekulių populiaciją. Galime pasakyti, kaip stipriai sąveikauja molekulės, kurioje vietoje sąveikauja su baltymu ir daug kitų parametrų“, – teigia tyrėjas.

Doc. M. Tutkus pažymi, kad jų sukurta platforma leidžia patobulinti pavienių molekulių biofizikinius metodus, nes pateikiami rezultatai yra tikslesni. Tokį preciziškumą lemia tai, kad stebint pavienes molekules pavyksta atskirti ir įvertinti neaktyvius baltymus.

„Jeigu baltymas prisijungia vienoje vietoje ir ten būna visą laiką – vadinasi, jis yra miręs. Mūsų sukurta platforma leidžia tokius baltymus iškart atmesti ir tirti tik tuos baltymus, kurie realiai veikia ir toliau sąveikauja. Kiti panašūs metodai neeliminuoja neaktyvių baltymų ir skaičiuoja baltymų aktyvumo vidurkį. Tai nėra tikslu“, – pasakoja mokslininkas.

„DNR užuolaidos“ – naujiems vaistams kurti

VU GMC mokslininkai, bendradarbiaudami su kolegomis iš Fizinių ir technologijos mokslų centro, ne tik vysto platformą „DNR užuolaidų“ metodui pagerinti, bet ir kuria reikiamus įrankius šiam metodui įgyvendinti.

„Naudojame minkštąją litografiją, kad sukurtume ant stiklo paviršiaus taškus, skirtus molekulėms prisijungti. Siekiame, kad DNR molekulės nesijungtų ant paviršiaus atsitiktinai, o būtų prisijungusios vienoje linijoje. Taip išdėliojame šias molekules lygiagrečiai viena kitai ir gauname tarsi užuolaidą“, – pristato tyrėjas.

Tik dviejose pasaulio laboratorijose naudojamą metodą VU mokslininkai nori pritaikyti taip, kad būtų nesudėtinga paruošti bandinį ir patogu bei nebrangu jį tirti. Tokiu atveju eksperimentai, kainuojantys tūkstančius eurų, atpigtų ir taptų prieinami daug daugiau mokslininkų visame pasaulyje.

„Siekiame užprogramuoti vietas stiklo paviršiuje, kur molekulės prisijungs, ir jas imobilizuoti – neleisti joms judėti. Eksperimento metu „įleidus“ molekules, jos savaime prisijungia užprogramuotose vietose. Tad turime tyrimo lauką, kuris apima 100 kvadratinių mikrometrų, ir galime tirti kelis šimtus DNR molekulių. Mūsų privalumas, kad šie užprogramuoti taškai nejuda laikui bėgant ir eksperimentą galime atlikti kelis kartus, taip sumažindami sąnaudas“, – privalumus vardija doc. M. Tutkus.

DNR užuolaidų metodas galėtų būti naudojamas vaistams kurti, nes padėtų įvertinti vaisto poveikį skirtingiems baltymams. Be to, stebėdami individualias ląsteles organizme, galime pamatyti, kaip vaistas veiks specifines ląsteles.

„Vis labiau artėjame prie personalizuotos medicinos, kur kiekvienam žmogui yra pritaikomas gydymas. Bet ne tik žmonės skiriasi vienas nuo kito, bet ir to paties žmogaus ląstelės ir net molekulės skiriasi viena nuo kitos. Supratę skirtumus mažiausiu lygmeniu, galėsime parinkti tinkamesnius vaistus. Pavyzdys galėtų būti vėžio ligos gydymas. Vėžys išsivysto tam tikro tipo ląstelėse ir tam tikroje organizmo vietoje, tad turėtume bandyti keisti ląsteles, kurios yra paveiktos. Tada ir prireikia tokių detalių įrankių, nes, norėdami pakeisti konkrečią molekulę, pirmiausia turime ją pamatyti“, – pasakoja tyrėjas.

Pavienės molekulės ant paviršiaus

Idėja komercinama startuolyje

VU ir FTMC mokslininkai yra įkūrę startuolį „Platformina“, kurio pagrindiniai klientai –mokslininkai, norintys tyrinėti baltymus ir DNR.

„Suinteresuotiems mokslininkams siunčiame tiek paruoštus šablonus, tiek visus reikalingus rinkinius: DNR molekules, rašalą, net ir paruoštus stiklo paviršius“, – pasakoja doc. M. Tutkus.

Startuolio siūlomų bandinių išskirtinumas – galimybė juos stebėti komerciniu mikroskopu vietoje brangiai kainuojančio, dažnai pačių mokslininkų rankomis sukonstruoto, specifine sistema paremto mikroskopo.

„Originali DNR užuolaidų platforma komerciniams mikroskopams yra nepritaikoma, nes bandiniai turi būti suformuoti ant storo stikliuko, o paprasto mikroskopo objektyvas su tokia platforma nesuderinamas. Mūsų siūloma sistema leidžia bandinį paruošti ant plonyčio stikliuko, kuris tinka komercinių mikroskopų objektyvui. Tai yra tikrai didelis privalumas, nes sumažėja eksperimento sąnaudos“, – sako tyrėjas.

Tokie molekulių tyrimai reikalauja ir labai jautrių kamerų, kurios gali aptikti kiekvieną sklindantį fotoną ir konvertuoti juos į sisteminius vienetus. Viena tokia labai jautri kamera gali kainuoti ir 20 000 eurų.

„Dirbame su gamintojais, gaminančiais pramonines kameras, kurios yra pakankamai jautrios, bet neturi reikiamos programinės įrangos. Šią įrangą, kaip ir trūkstamą elektroniką, mes gaminame patys ir integruojame. Galiu pasidžiaugti, kad mūsų kamerų pasiekimai yra tokie patys kaip tų kamerų, kurios kainuoja 20 000 eurų. Tikimės, kad tai atvers duris mokslininkams, kurie negali nusipirkti pačių brangiausių kamerų, bet nori vykdyti šios srities mokslinius tyrimus“, – sako doc. M. Tutkus.

Be DNR užuolaidų platformos, VU mokslininkai kolegoms iš kitų laboratorijų siūlo ir specialų mikroskopijos sprendinį su superrezoliucija ir vidaus atspindžio režimu.

„Šis mikroskopijos sprendinys yra visiškai pritaikomas DNR užuolaidų metodui, tad ateityje galvojame sujungti mikroskopijos sistemą ir DNR sąveikos su baltymais platformą ir visa tai pardavinėti kaip rinkinį“, – teigia mokslininkas.